IGF-1 LR3 Ліофілізований,The freeze-dried long-acting insulin-like growth factor-1 LR3 formulation uses low-temperature vacuum drying technology to remove moisture, preventing peptide degradation or aggregation in liquid formulations and extending the shelf life (usually up to 2 years at -20 ℃). It can be directly used after reconstitution, reducing transportation and storage costs. At the same time, the freeze-drying process can remove impurities and improve the purity of the formulation (usually>95%). Однак тривале-застосування може призвести до десенсибілізації рецепторів і вимагати періодичного введення. Високі дози можуть викликати гіпоглікемію, тому необхідно контролювати рівень глюкози в крові.
Ми пропонуємо не тільки чистий порошок і капсули, а й інші лікарські форми. Якщо необхідно, зв’яжіться з нашою командою продажів.
Наші вироби з
IGF-1 LR3 COA
Клонування генів і побудова вектора експресії
Генна конструкціяIGF-1 LR3 Ліофілізованийзаснований на послідовності природного IGF-1, але з такими ключовими модифікаціями:
N-термінальне подовження: додайте 13 амінокислот (MFPAMPLSSLFFN) до N-кінця IGF-1, щоб подовжити його період напіврозпаду та підвищити його біологічну активність.
Заміна амінокислоти: замініть глутамінову кислоту (Glu) у позиції 3 IGF-1 аргініном (Arg), тобто модифікацією R3, щоб зменшити здатність зв’язування з IGFBP і збільшити вільну концентрацію.
синтез генів
Отримайте цільовий фрагмент гена шляхом хімічного синтезу або ПЛР-ампліфікації на основі розробленої послідовності гена IGF-1 LR3. Хімічний синтез зазвичай використовує технологію твердофазного синтезу, поступово додаючи нуклеотиди та, нарешті, синтезуючи повні фрагменти генів. ПЛР-ампліфікація використовує відомі послідовності IGF-1 для розробки праймерів і ампліфікації цільового гена за допомогою реакції ПЛР.
Вибір відповідного вектора експресії є вирішальним кроком у експресії білка. Зазвичай використовувані експресійні вектори включають серії pET (такі як pET30a), серії pGEX тощо. Ці вектори мають ефективні промотори, численні сайти клонування та послідовності міток (такі як мітки His), які полегшують подальше очищення білка та виявлення.
Наприклад, етапи конструювання вектора експресії pET30a такі:
Ферментативне розщеплення: використовуйте ендонуклеази рестрикції, такі як BamHI та XhoI, для виконання подвійного ферментного розщеплення на векторі pET32a та фрагменті гена IGF-1 LR3, утворюючи комплементарні липкі кінці.
З’єднання: розщеплений ферментом вектор і фрагмент гена з’єднані за допомогою ДНК-лігази T4 для утворення рекомбінантного вектора експресії pET32a-LR3-IGF1.
Трансформація: трансформуйте рекомбінантний вектор експресії в компетентні клітини E. coli (такі як DH5) і отримайте позитивні клони за допомогою скринінгу на антибіотики (такі як ампіцилін).
Ідентифікація: підтвердьте правильність рекомбінантного вектора експресії за допомогою таких методів, як ПЛР колонії, ідентифікація ферментного розщеплення або секвенування.
Експресія білка
Відбір експресійних штамів
Вибір відповідного штаму експресії має вирішальне значення для експресії білка. Штами експресії, які зазвичай використовуються, включають Rosetta (DE3), BL21 (DE3) тощо. Ці штами мають ефективні системи РНК-полімерази Т7 і можуть ефективно експресувати гени, керовані промотором Т7.
Беручи як приклад Rosetta (DE3), його характеристики включають: містить ген РНК-полімерази Т7, індукований експресією IPTG. Несучі гени тРНК рідкісних кодонів можуть ефективно експресувати екзогенні гени, що містять рідкісні кодони. Підходить для експресії токсичних білків або білків, які важко експресувати.
Оптимізація умов вираження
Умови експресії білка, такі як концентрація індуктора, температура індукції, час індукції тощо, мають значний вплив на вихід і якість білка. Шляхом оптимізації умов експресії можна збільшити рівень експресії IGF-1 LR3.
Концентрація індукуючого агента: IPTG є широко використовуваним індукуючим агентом, з концентрацією зазвичай між 0,1-1 мМ. Визначте оптимальну концентрацію IPTG за допомогою градієнтних експериментів для досягнення найвищого рівня експресії білка.
Температура індукції: температура індукції зазвичай вибирається в межах 16-37 градусів. Більш низькі температури (наприклад, 16-20 градусів) можуть допомогти зменшити деградацію білка та утворення тілець включення, а також збільшити вихід розчинних білків.
Час індукції: час індукції зазвичай становить від 2 до 24 годин, а оптимальний час індукції визначається шляхом аналізу рівнів експресії білка шляхом відбору зразків за часом.
Виявлення експресії білка
ВираженняIGF-1 LR3 Ліофілізованийбуло виявлено методами SDS-PAGE та Вестерн-блот.
SDS-PAGE: Зберіть зразки бактерій до та після індукції, виконайте ультразвукову фрагментацію або хімічний лізис, центрифугуйте, щоб відокремити супернатант і осад, і виконайте окремо SDS{1}}аналіз PAGE. Шляхом порівняння змін білкових смуг у супернатанті та осаді до та після індукції було підтверджено експресію IGF-1 LR3.
Вестерн-блот: використовуйте специфічні антитіла (такі як анти-His-tag антитіла або анти-IGF-1 антитіла) для проведення імуноблот-аналізу білків, розділених SDS-PAGE, щоб додатково підтвердити експресію та молекулярну масу IGF-1 LR3.
Очищення білків
Лізис бактерій
Зберіть індуковані бактеріальні клітини та лізуйте їх для вивільнення внутрішньоклітинних білків. Загальні методи крекінгу включають ультразвукову фрагментацію, гомогенізацію під високим-тиском, хімічний крекінг тощо. Для прикладу ультразвукова фрагментація виконує такі дії:
Збір бактерій: відцентрифугуйте бактеріальний розчин індукованої експресії, щоб зібрати бактеріальні клітини, і ресуспендуйте їх у буфері для лізису (такому як буфер PBS або Tris HCl).
Ультразвукова фрагментація: бактеріальну суспензію поміщають у крижану баню та подрібнюють за допомогою ультразвукового руйнівника, зазвичай із застосуванням короткочасного -методу множинної фрагментації (наприклад, 10 секунд кожного разу, 10-секундний інтервал, повторення 10 разів), щоб уникнути денатурації білка через перегрів.
Центрифужне розділення: відцентрифугуйте подрібнену бактеріальну суспензію, щоб відокремити супернатант і осад. Супернатант містить розчинні білки, тоді як осад може містити тільця включення або залишки клітин.
Афінна хроматографія
Через те, що рекомбінантний IGF-1 LR3 зазвичай містить His-мітку, його можна очистити за допомогою афінної хроматографії з іонами нікелю (Ni NTA).
Підготовка колонки: завантажте наповнювач Ni NTA у хроматографічну колонку та врівноважте її буфером для врівноваження (наприклад, PBS, що містить 20 мМ імідазолу).
Завантаження зразка: завантажте супернатант бактеріального лізату на хроматографічну колонку, дозволяючи IGF-1 LR3 з His-міткою зв’язатися з іонами нікелю.
Промивання: промийте хроматографічну колонку промивним буфером (наприклад, PBS, що містить 50 мМ імідазолу), щоб видалити незв’язані або слабко зв’язані білки-домішки.
Елюювання: використовуйте буфер для елюції (наприклад, PBS, що містить 250 мМ імідазолу), щоб елюювати IGF-1 LR3, зв’язаний з хроматографічною колонкою, і зберіть елюент.
Опріснення та концентрація
Розчин IGF-1 LR3 після елюювання містить високу концентрацію імідазолу, який потрібно видалити за допомогою знесолення та концентрації для підвищення концентрації білка.
Опріснення: використовуйте опріснювальну колонку або діалізний мішок, щоб видалити імідазол з елюенту та замінити його відповідним буферним розчином (наприклад, PBS).
Концентрація: сконцентруйте знесолений розчин білка за допомогою ультрафільтраційних трубок або відцентрових концентраторів, щоб підвищити концентрацію білка до бажаного рівня.
Перевірка чистоти та активності
Чистоту та активність очищеного IGF-1 LR3 виявляли методами SDS-PAGE, HPLC або ELISA.
Сторінка SDS-: проаналізуйте чистоту очищеного білка та переконайтеся, що немає очевидних смуг домішок.
ВЕРХ: використовуйте ВЕРХ з оберненою фазою або ВЕРХ із виключенням розміру для подальшого аналізу чистоти та розподілу молекулярної маси білків.
ELISA: Імуноферментний аналіз (ELISA) використовується для виявлення біологічної активності IGF-1 LR3, і рівень його активності відображається ступенем зв’язування зі специфічними антитілами.
Процес сублімаційної сушки
Принцип сублімаційної сушки
Ліофілізація – це техніка сушіння, яка видаляє вологу шляхом-заморожування при низькій температурі та сублімації під вакуумом. Процес-ліофілізаційного сушіння включає три етапи: попереднє заморожування, сублімаційне сушіння та десорбційне сушіння, які можуть максимізувати активність і стабільність білка.
Етапи сублімаційного сушіння
Розділіть очищений розчин IGF-1 LR3 у пляшки для сублімаційної сушіння або пляшки з пеніциліном і помістіть їх у сублімаційну сушарку для попереднього заморожування нижче -40 градусів, щоб повністю заморозити розчин.
Поступово підвищуйте температуру приблизно до -20 градусів в умовах вакууму, дозволяючи льоду сублімувати безпосередньо у водяну пару та видалити більшу частину вологи. На цьому етапі необхідно контролювати швидкість нагрівання та ступінь вакууму, щоб уникнути денатурації або колапсу білка.
Далі підвищте температуру до 20-30 градусів, щоб видалити залишкову вологість і зменшити вміст вологи в ліофілізованому продукті до рівня нижче 1%. На цьому етапі необхідно підтримувати високий ступінь вакууму, щоб забезпечити повне видалення вологи.
Після завершення висихання швидко закрийте пляшку сублімаційної-сушки або пляшку пеніциліну, щоб запобігти повторному потраплянню вологи.
Захист сублімаційної сушки
Щоб захистити активність і стабільність IGF-1 LR3 під час-ліофілізаційного сушіння, зазвичай необхідно додавати сублімаційні-захисні засоби. Загальні захисні засоби для сублімаційної сушки включають:
- Вуглеводи: такі як альгінат, сахароза, глюкоза тощо, можуть утворювати склоподібні структури та стабілізувати конформацію білка.
- Такі полімери, як поліетиленгліколь (PEG) і полівінілпіролідон (PVP), можуть збільшити в'язкість розчинів і зменшити агрегацію білка.
- Амінокислоти, такі як гліцин і аланін, можуть діяти як донори або акцептори водневих зв'язків, стабілізуючи структуру білків.
- Поверхнево-активні речовини, такі як Tween 20, Tween 80 тощо, можуть зменшити адсорбцію білків на стінках контейнера та підвищити швидкість відновлення.
Беручи як приклад трегалозу, кількість її додавання зазвичай в 1-10 разів перевищує масу білка, що може утворювати захисний шар під час ліофільної сушки для запобігання денатурації білка.
Оптимізація процесу сублімаційної сушки
Оптимізація процесу-ліофілізаційного сушіння має вирішальне значення для покращення якостіIGF-1 LR3 Ліофілізований. Регулюючи такі параметри, як температура попереднього заморожування, температура сублімаційного сушіння, аналітична температура сушіння та ступінь вакууму, можна досягти найкращого ефекту сублімаційного-сушіння.
Температура попереднього замерзання
Температура попереднього заморожування повинна бути нижчою за евтектичну точку білка, щоб забезпечити повне заморожування розчину. Зазвичай вибирають температуру нижче -40 градусів.
Температура сублімаційного сушіння
Температура сублімаційного сушіння має бути нижчою за температуру руйнування білка, щоб уникнути денатурації білка або руйнування контейнера. Зазвичай вибирають близько -20 градусів.
Аналіз температури сушіння
Температура сушіння аналізу повинна бути вищою за температуру сублімаційного сушіння для видалення залишкової вологи. Зазвичай вибирають 20-30 градусів.
Ступінь вакууму
Ступінь вакууму слід підтримувати на низькому рівні (наприклад,<100 mTorr) to promote the sublimation and removal of moisture.
Популярні Мітки: igf-1 lr3 ліофілізований, Китай igf-1 lr3 ліофілізований виробники, постачальники
